В 1872 году она поступила в таганрогскую женскую гимназию. После переезда в Москву закончила среднее образование в московском Филаретовском Епархиальном училище, а затем поступила на Высшие женские историко-литературные курсы профессора Владимира Герье, известного русского историка и общественного деятеля. Там сестра Чехова училась до 1886 года.

С осени 1886 по 1904 год Мария состояла преподавательницей истории и географии в частной женской гимназии Ржевской в Москве. В 90-х годах она увлеклась живописью, училась в Строгановском училище, а потом в частной студии Александры Хотяинцевой под руководством знаменитых художников Валентина Серова и Константина Коровина. Но в выборе жизненного пути решающую для нее роль сыграл брат Антон. Когда стало понятно, что он станет великим писателем, Мария посвятила себя брату, заботе о семье и ведению быта. Во время жизни в Мелихове она помогала брату в строительстве школ, лечении крестьян, хозяйственных работах. Сам писатель так отзывался о сестре в письме Александру Смагину 21 ноября 1891 года: «Мария Павловна у нас главная, и без нее каша не варится. Я полагаюсь во всем на нее». 

Владимир Немирович-Данченко писал:

Помимо создания музея Чехова в Ялте, Мария деятельно участвовала в создании музеев в Москве, позже — в Мелихове. Подарила этим новосозданным музеям множество вещей, рукописи (некоторые письма). Основной же литературный архив она передала Государственной библиотеке СССР имени Ленина с условием, что этот архив будет предоставляться для работы лицам, пишущим труды о Чехове.

Мария Чехова умерла в Ялте в возрасте 93 лет.